RT-PCR
רוורס טרנסקריפשן PCR (באנגלית Reverse transcription polymerase chain reaction), תרגום מילולי- שיעתוק הפוך- תגובת שרשרת של פולימראז) או RT-PCR היא טכניקה המשמשת בביולוגיה מולקולרית להגברת רצפי RNA. הטכניקה מבוססת על שיעתוק הפוך של רצפי RNA ל DNA ולאחר מכן PCR- הכפלת מקטע DNA ספציפי מספר רב של פעמים ליצירת אמפליקון.
רקע
בכל היצורים המידע הגנטי אצור בDNA הגנומי. הDNA מכיל גנים המקודדים לחלבונים וכן מקטעים ארוכים שאינם מקודדים לחלבונים. בכל היצורים אין כל הגנים מבוטאים (כלומר משועתקים ל mRNA) באותה העת. כך לדוגמה, בחיידקים מבוטאים גנים לפירוק חומרי תזונה שונים (כמו לקטוז) רק כאשר החומר מצוי בסביבת החיידק. באופן דומה, ביצורים רב תאיים חלבונים שונים מבוטאים בסוגים שונים של תאים, כך לדוגמה אינסולין מיוצר אך ורק בתאי בטא שבלבלב. מאחר שmRNA מתורגם לחלבון יש חשיבות רבה בחקר ריצפו, רק על ידי בדיקת רצף mRNA ניתן רצף החלבון כיוון שרצף הDNA מכיל אלמנטים שאינם מבוטאים בחלבון כגון אינטרונים בנוסף גנים רבים עוברים שיחבור חלופי כך שרצף DNA יחיד יכול ליצור מספר חלבונים.
טכניקת RT-PCR
RT-PCR מבוסס על שני שלבים עיקריים:
1- שיעתוק הפוך- הפיכת RNA ל DNA משלים – cDNA בעזרת אנזים רוורס טרנסקריפטאז המופק מוירוס משפחת רטרו וירוסים כגון M-MLV האנזים משמש את הוירוס בהפיכת RNA ויראלי לDNA כחלק ממחזור החיים של הוירוס. פרט לאנזים מכילה הריאקציה RNA, נוקליאוטידים (dNTP), בופר, ופריימר: בתגובת RT-PCR מקטע DNA קצר נקשר לקצהו של ה RNA- פריימר, כאשר ידוע מקטע הRNA הרצוי הפריימר יהיה ההופכי המשלים שלו, כאשר לא ידוע המקטע או יש עניין במספר מקטעים המקודדים לחלבון ניתן להשתמש בפריימר המכיל רצף בן 15–25 חומצות גרעין של תימין – poly dT. פריימר זה נקשר ל mRNA באתר הפולי אדנילציה. כאשר מקטע הmRNA אינו מקודד לחלבון ולכן אינו מכיל אתר פולי אדנילציה כמו ב small RNA, או tRNA יש להשתמש בפרימרים אקראיים.
בסיום השלב יש לחמם את תערובת הריאקציה ל 95 מעלות כדי לפרק את הקשר בין ה DNA לRNA.
2- PCR- לאחר יצירת cDNA ניתן השתמש בו כתבנית לPCR כמו כל DNA. ריאקצית PCR מכילה: אנזים Taq polymerase או אנזים DNA פולימראז תרמופילי אחר, נוקליאוטידים, שני פרימרים, cDNA ובופר מתאים. הריאקציה מורכבת ממספר מחזורים – בדרך כלל 20–40 בני שלושה שלבים כל אחד- דנטורציה (בטמפרטורה 95 מעלות), אנילינג (בטמפרטורה 55–65 מעלות בדרך כלל) ופולימריזציה (טמפרטורה של 72 מעלות).
